Джастин Джейкоб Лонг родился 2 июня 1978 в городке Фэрфилд штата Коннектикут в семье профессора философии Джеймса Лонга и бродвейской актрисы Венди Лесняк, Джастин Лонг был средним сыном в семье. Родители-католики воспитывали троих своих сыновей достаточно строго. Все они, однако, стали актёрами.
Воспитывался Лонг по строгим религиозным правилам, родители были католиками.
Джастин посещал иезуитскую школу. Здесь, в школьных любительских постановках он впервые показал себя талантливым актёром, и уже в четырнадцать лет он сыграл в своём первом сериале. По окончании школы Джастин поступил в колледж Вассара, известный не только высоким уровнем преподавания, но и свободными, демократическими устоями. Колледж Вассара знаменит, прежде всего, благодаря так называемой Труппе Вассара – театральному объединению, воспитавшему не одно поколение выдающихся комедийных актёров. В постановках труппы Джастин Лонг оттачивает своё мастерство, даже выступает наставником, помогая первокурсникам, и обращает на себя внимание ролью в комедии «Посмешище». Ещё до окончания колледжа Джастину предлагают сниматься в полнометражном коммерческом фильме «В поисках галактики». Однако учёба остаётся для Джастина приоритетом, и он отказывается сниматься в течение полного дня вплоть до выпуска из колледжа.
До окончания Вассар-колледжа в 2000 году у Лонга уже была масса актерского опыта, который он получил во время учебы. Помимо того, Джастин два года был членом группы комедиантов «Посмешище», которая ставила школьные спектакли. Также Лонг рано начал работать в ряде театров за пределами школы, включая New York Stage & Film, Westport Theatre Artists Group и Fairfield Summer Theatre.
Кинодебют Джастина состоялся в научно-фантастическом фильме «В поисках Галактики», в котором он сыграл Брэндона, эта роль стала прорывом для Лонга. Вскоре после этого он получил постоянную роль в сериале «Эд». Джастин снимался в шоу четыре года, но во время перерывов между сьемками серий продолжал работать в кино.
Затем Лонгу поступило предложение сыграть роль в подростковом фильме «Летние забавы», а потом главную роль в фильме ужасов «Джиперс Криперс» и «Джиперс Криперс 2» (2003).
Его появление в «Перекрестки» (2002), фильм-дебют Бритни Спирс, к счастью, не повлияло на его карьеру, хотя фильм был провальным в прокате и получил много критики.
После сьемок с Беном Стиллером и Винсом Воном в комедии «Вышибалы», он получил главную роль в романтической комедии «Сумасшедшие гонки» (2005) с Линдсей Лохан.
Всегда рад сыграть различные роли, будь то комедия или драматический фильм, в 2006 году Джастин продолжает делать успешную кинокарьеру, снявшись в пяти картинах, включая роль второго плана в «Развод по-американски» в главной роли Дженнифер Энистон с Винсом Воном и главную роль в «Нас приняли!» для Universal Pictures.
Во время съемок кинокомедии «Обещать - не значит жениться» (2009) Лонг встретился с Дрю Бэрримор после чего они начали встречаться. После краткого разрыва, они возобновили отношения, а затем снова снялись вместе в романтической комедии «На расстоянии любви» (2010).
С 2006 Лонг - один из представителей известной американской марки в рекламной компании Get a Mac. Несмотря на то, что актер постоянно снимается в рекламах компьютеров «Макинтош», он весьма далек от мира высоких технологий. «Я выгляжу, как какой-нибудь хакер, но ничего не знаю о компьютерах», - признается Лонг.
Джастин любит подражать разным голосам и озвучивать фильмы – как он говорит, «создавать целого персонажа одним своим голосом, забыв о теле». Лонг считает себя довольно ранимым человеком, поэтому старается не читать ничего, что пишут о нем в СМИ.